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持續緩釋抗炎蛋白的可涂黏附性水凝膠心臟貼片！用于心肌梗死的修復

嘉峪檢測網 2023-09-10 09:33

心血管疾病導致全世界每年超過1790萬人死亡，以心肌梗死(MI)為代表的缺血性心臟病是心血管疾病相關死亡的主要原因。心肌梗死再灌注后發生不可逆的病理重構，包括左心室擴張和心肌梗死后的過度炎癥反應，常常導致致命性的功能損害。

基于此，來自韓國忠南國立大學的Youngkeun Ahn和韓國光州科學技術學院的Jae Young Lee開發了一種使用葡聚糖醛(Dex-ald)和明膠的可涂性和粘附性水凝膠貼片，將抗炎蛋白ANGPTL4加入水凝膠中，直接向梗塞心臟持續釋放，以減輕炎癥。

1. 作者優化了材料的組成，包括聚合物的濃度和分子量。該水凝膠在135秒內形成原位凝膠，具有心臟組織生理模量(40.5 kPa)，合適的組織粘附性(4.3 kPa)，以及優異的機械穩定性。ANGPTL4從明膠/dex-ald水凝膠中持續釋放，明膠/dex-ald水凝膠可以方便地涂在跳動的心臟上并在體內降解。

2. 體內研究表明，含有ANGPTL4的水凝膠心臟貼片可顯著改善心臟組織修復。經ANGPTL4水凝膠貼片處理的心臟組織血管化增加，炎癥巨噬細胞減少，心臟細胞結構成熟。該水凝膠系統具有易涂性、適當的組織粘連性和抗炎藥物的持續釋放，將成為修復各種組織的有效平臺，包括心臟、肌肉和軟骨。

相關論文“A paintable and adhesive hydrogel cardiac patch with sustained release of ANGPTL4 for infarcted heart repair”于2023年8月29日發表于雜志《Bioactive Materials》上。

圖1 可涂膠水凝膠的示意圖

1. 可涂水凝膠的設計與制備

使用明膠和葡聚糖作為基礎水凝膠材料，因為它們具有固有的粘附性和生物相容性。將右旋糖酐修飾為dex-ald，它可以通過希夫反應與明膠和心臟組織自發反應，分別與心外膜形成共價水凝膠網絡和強粘連鍵，使水凝膠可以涂在左室心外膜上(圖1)。在明膠含量恒定(10%)的情況下，dex-ald的濃度在1%到5%之間變化。混合料中dex-ald含量越高，彈性模量增加越快，膠凝時間越短。此外，含有更多dex-ald的凝膠具有更高的模量(圖2A和B)。結果表明，密集存在于dex-ald鏈上的醛基與明膠中的胺基形成席夫堿鍵的接近性和反應性有限，需要比胺基更大的醛含量才能形成網絡。明膠含量從2.5%到10%的變化，在恒定的dex-ald含量(5%)下，對凝膠化時間沒有實質性影響(圖2C和D)。然而，明膠/dex-ald的彈性模量隨著明膠含量的增加而增加。此外，用不同分子量的葡聚糖(150 kDa、500 kDa和1.5 MDa)制備不同的葡聚糖前體和明膠/葡聚糖水凝膠。有趣的是，由dex-ald(由500 kDa葡聚糖氧化而成)和10%明膠組成的前體溶液形成凝膠的速度比其他溶液快(圖2E和F)。流變學研究表明，用dex-ald (500 kDa右旋糖酐)制備的水凝膠在1Hz下具有更高的存儲模量(G’)，為13.5±1.2 kPa，與凝膠時間相反(圖2G和H)。此外，通過將混合前驅體溶液以螺旋或直線的方式應用于玻璃管上，驗證了水凝膠的可注射性和可涂性。雙注射器注射后水凝膠保持穩定不流動(圖2I)。SEM圖像顯示出孔徑為3.8±1.7μm的高孔隙結構(圖2J)。

圖2 可涂明膠/dex-ald水凝膠的制備與表征

2. 明膠/dex-ald水凝膠的粘附性

作者目標是開發一種不需要手術縫合并穩定支持心外膜機械性能的粘性水凝膠心臟貼片。因此，研究了明膠/dex-ald 水凝膠的粘附特性（圖3）。將由10%明膠和5% dex-ald組成的水凝膠注射到組織片上，然后將另一個組織片覆蓋到水凝膠上（圖3A）。該水凝膠對豬心外膜和皮膚的界面粘合強度分別為4.2±0.3kPa和19.5±1.7kPa（圖3A和B）。此外，水凝膠粘合組織的循環伸長不會引起粘合強度的實質性變化（圖3C），表明具有優異的持久組織粘合力。在扭轉、彎曲和水沖洗等各種變形下，水凝膠仍牢固地附著在心外膜上（圖3D）。

圖3 可涂水凝膠的粘附性能

3. ANGPTL4從明膠/dex-ald水凝膠中釋放

由于ANGPTL4可以通過可逆席夫堿與dex-ald 發生化學鍵合，因此ANGPTL4具有高負載能力和持續釋放。將ANGPTL4與dex-ald溶液混合進行偶聯，然后將其與明膠混合，得到負載ANGPTL4的水凝膠(A4/明膠/dex-ald)。使用Cy5共軛ANGPTL4負載的水凝膠檢測ANGPTL4從水凝膠中的釋放譜(圖4A)。A4/明膠/ dexald在早期孵育時間點表現出持續釋放的特征，沒有明顯的爆發釋放(圖4B)。ANGPTL4持續釋放，并在第7天達到飽和釋放，表明ANGPTL4在水凝膠內保持穩定。A4/明膠/dex-ald在酸性緩沖液(pH 5.8)中比在中性緩沖液(pH 7.4)中釋放ANGPL4更快。結果表明，酸性條件下，ANGPTL4與水凝膠基質之間的席夫堿會逐漸失穩，從而促進ANGPTL4的釋放。由于心肌梗死心臟呈輕微酸性pH值，根據心肌梗死的嚴重程度，可能會誘導ANGPTL4的釋放(圖4C)。

圖4 A4/明膠/dex-ald水凝膠和明膠水凝膠中ANGPTL4的體外釋放

4. 明膠/dex-ald水凝膠體外細胞培養

通過在直接和間接培養模式下用明膠/dex-ald水凝膠培養原代心肌細胞（CMs）來研究細胞相容性。LDH 測定顯示，在明膠/dex-ald水凝膠中培養的CM在長達7天的時間內表現出優異的細胞活力（圖5A）。此外，在Transwell插入物中以水凝膠作為間接接觸模式培養的CM具有高達7天的高活力 (>95%)（圖5B）。活/死染色表明，在帶有水凝膠的 Transwell 插入物中培養的CM與在組織培養板(TCP)上培養的CM之間的細胞活力沒有顯著差異（圖5C和D）。如圖5E所示，在培養第7天在水凝膠上培養的CM中觀察到α-肌動蛋白的高表達和獨特的肌節結構。

圖5 體外細胞毒性試驗

5. 明膠/dex-ald 的體內可涂性和可降解性

使用活體大鼠檢查了明膠/dex-ald 水凝膠作為可涂心臟貼片的適用性。水凝膠成功覆蓋了整個左心室，包括梗塞區，并且在跳動心臟的左心室上保持完整（圖6A）。在處理后的第7天和第14天，通過收集心臟組織來檢測涂覆明膠/dex-ald水凝膠的體內生物降解性(圖6B)，結果顯示涂覆的水凝膠逐漸降解。第7天和第14天，心臟上的初始貼片分別保留了46.6%和30.0%，這表明明膠/dex-ald貼片在體內是可降解的。

圖6 明膠/dex-ald水凝膠在心臟上的可涂性和可降解性的體內研究

6. 負載ANGPTL4的可涂水凝膠修復心臟

為了確定A4/明膠/dex-ald貼片是否能改善心肌梗死(MI)后的心功能，在心肌梗死后第14天用超聲心動圖測量了心室收縮力。假手術組、MI組、明膠/dex-ald水凝膠貼片的MI和A4/明膠/dex-ald水凝膠貼片的MI實驗組如圖7A所示。代表性超聲心動圖顯示MI組左室尺寸增大，室間隔和后壁運動減弱，而明膠/dex-ald和A4/明膠/dex-ald組減弱(圖7B)。與MI組相比，以EF和FS為特征的收縮功能障礙在明膠/dex-ald和A4/明膠/dex-ald組中均減弱（圖 7C）。FS(%)值顯示出與EF(%)相似的趨勢(圖7D)。A4/明膠/dex-ald組的EF(%)和FS(%)回收率優于明膠/dex-ald組。結果表明水凝膠貼片（明膠/dex-ald和A4/明膠/dex-ald）對心臟功能恢復具有積極作用，并且A4的摻入進一步改善了功能恢復。使用馬松三色染色分析MI誘導的纖維化疤痕形成（圖7E）。A4/明膠/dex-ald治療后纖維化面積顯著減少，小于MI和明膠/dex-ald組的纖維化面積（圖7F）。此外，在貼片治療組中，左心室壁厚度的減少有所減弱，其中負載A4的心臟貼片更有效（圖7G）。

圖7 明膠/dex-ald水凝膠心臟貼片對MI后心臟功能和重塑的影響

接下來，使用α-SMA和vWF免疫熒光染色確定了水凝膠貼片在血管生成中的作用。與MI和明膠/dex-ald組相比，A4/明膠/dexald 貼片治療顯著增加了新血管形成，特別是在邊緣區域（圖 8A）。A4/明膠/dex-ald貼片組中血管生成的增強可能歸因于ANGPTL4的促血管生成能力和炎癥的減少。此外，通過CD68（全巨噬細胞標記物）和CD206（抗炎巨噬細胞標記物）染色來評估巨噬細胞的類型和分布（圖8B）。結果表明，使用水凝膠心臟貼片局部遞送 ANGPTL4 可通過促進抗炎和血管生成來有效誘導心臟修復途徑。

圖8 MI后2周大鼠心臟組織的代表性免疫熒光圖像

綜上，作者成功開發了生物相容性和粘附性水凝膠，能夠使用10%明膠和5% dex-ald通過希夫堿原位形成凝膠。這種水凝膠適用于心臟貼片，可以通過穩定的組織粘附力而無需縫合而附著在心外膜上，為心肌梗死后有效的心臟修復提供組織般的柔軟度和機械支撐。此外，將組織再生因子ANGPTL4負載到明膠/dex-ald水凝膠上進行局部持續遞送。負載ANGPTL4的水凝膠貼片改善了心肌梗死的功能恢復并防止病理組織重塑。免疫組織學分析表明，負載 ANGPTL4的水凝膠貼片增強了梗塞心肌中的血管生成并增加了抗炎巨噬細胞的數量。

文章來源：https://doi.org/10.1002/adfm.202307766

來源：Internet

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